С обложки: Проглатывание штамма Lactobacillus регулирует эмоциональное поведение и центральную экспрессию ГАМК-рецептора у мыши через блуждающий нерв

1. Аннотация Существует все больше, но в основном косвенных данных, свидетельствующих о влиянии комменсальной...
2. Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на уровень кортикостерона, вызванного стрессом.
3. Влияние L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию ГАМК-рецепторов.
4. МРНК GABAAα2.
5. Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на поведение ваготомизированных мышей.
6. Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию мРНК рецептора ГАМК: роль блуждающего нерва.
7. МРНК GABAAα2.
8. GABAAα1 мРНК.
9. обсуждение

Аннотация

Существует все больше, но в основном косвенных данных, свидетельствующих о влиянии комменсальной кишечной микробиоты на центральную нервную систему (ЦНС). Однако неизвестно, могут ли молочнокислые бактерии, такие как Lactobacillus rhamnosus, оказывать прямое влияние на рецепторы нейротрансмиттеров в ЦНС у нормальных, здоровых животных. ГАМК является основным нейротрансмиттером, ингибирующим ЦНС, и значительно участвует в регуляции многих физиологических и психологических процессов. Изменения в экспрессии центрального ГАМК-рецептора связаны с патогенезом тревоги и депрессии, которые в высокой степени сопутствуют функциональным расстройствам кишечника. В этой работе мы показываем, что хроническое лечение с помощью L. rhamnosus ( JB-1 ) индуцирует зависимые от региона изменения в мРНК GABAB1b в головном мозге с увеличением корковых областей (поясной и предлимбической) и сопутствующим снижением экспрессии в гиппокампе, миндалине, и locus coeruleus по сравнению с контрольными мышами. Кроме того, L. rhamnosus ( JB-1 ) снижал экспрессию мРНК GABAAα2 в префронтальной коре и миндалине, но увеличивал GABAAα2 в гиппокампе. Важно, что L. rhamnosus ( JB-1 ) снижал вызванное стрессом кортикостерон, а также поведение, связанное с тревогой и депрессией. Кроме того, нейрохимические и поведенческие эффекты не были обнаружены у мышей с ваготомией, идентифицирующих блуждающий нерв как основной модулирующий конститутивный коммуникационный путь между бактериями, подвергающимися воздействию кишечника и мозга. Вместе эти результаты подчеркивают важную роль бактерий в двунаправленном сообщении оси кишки и мозга и предполагают, что определенные организмы могут оказаться полезными терапевтическими добавками при связанных со стрессом расстройствах, таких как тревога и депрессия.

Ключевые слова: ось мозг-кишка, синдром раздраженного кишечника, пробиотик, формирование страха, познание

Появляется все больше данных, свидетельствующих о взаимодействии между микробиотой кишечника, кишечником и центральной нервной системой (ЦНС) в том, что называется осью микробиом-кишка-мозг ( 1 - 4 ). Исследования на грызунах выявили нарушение регуляции этой оси при функциональных расстройствах кишечника, включая синдром раздраженного кишечника. Действительно, на внутреннее восприятие у грызунов могут влиять изменения в микробиоте кишечника ( 5 ). Более того, было показано, что отсутствие и / или модификация микрофлоры кишечника у мышей влияет на реакцию оси гипоталамус-гипофиз-надпочечник (HPA) на стресс ( 6 , 7 ) и тревожное поведение ( 8 , 9 ), что важно, учитывая высокую сопутствующую патологию между функциональными желудочно-кишечными расстройствами и психическими расстройствами, связанными со стрессом, такими как тревога и депрессия ( 10 ). Кроме того, патогенные бактерии у грызунов могут вызывать тревожное поведение, которое опосредуется через вагальные афференты ( 9 , 11 ).

ГАМК является основным ингибирующим нейротрансмиттером ЦНС, действие которого опосредуется двумя основными классами рецепторов - ионотропными ГАМК-рецепторами, которые существуют в виде ряда подтипов, образованных в результате совместной сборки различных субъединиц (α, β и γ-субъединиц ссылка 12 ) и рецепторы GABAB, которые связаны с G-белком и состоят из гетеродимера, состоящего из двух субъединиц (GABAB1 и GABAB2), оба из которых необходимы для функциональности рецептора GABAB ( 13 ). Эти рецепторы являются важными фармакологическими мишенями для клинически значимых средств против беспокойства (например, бензодиазепинов, действующих на рецепторы GABAA), и изменения в GABAergic системе играют важную роль в развитии связанных со стрессом психических состояний.

Пробиотические бактерии - это живые организмы, которые могут обитать в кишечнике и способствовать здоровью хозяина ( 14 ). Накопленные клинические данные свидетельствуют о том, что пробиотики могут модулировать стрессовую реакцию и улучшать настроение и симптомы тревоги у пациентов с хронической усталостью и синдромом раздраженного кишечника ( 15 , 16 ). Одним из таких организмов является Lactobacillus rhamnosus ( JB-1 ), который, как было продемонстрировано, модулирует иммунную систему, поскольку он предотвращает индукцию IL-8 TNF-α в клеточных линиях эпителия толстой кишки человека (T84 и HT-29) ( 17 ) и модулирует воспаление путем генерации регуляторных Т-клеток ( 18 ). Более того, он ингибирует кардио-вегетативный ответ на колоректальное растяжение (CRD) у крыс ( 19 ), снижает ХОБЛ-индуцированную возбудимость дорсальных корешков 20 ) и влияет на подвижность тонкой кишки ( 21 ).

В настоящее время неясно, могут ли потенциальные пробиотики, такие как L. rhamnosus ( JB-1 ), влиять на функцию мозга, особенно у нормальных, здоровых животных. С этой целью мы попытались оценить, могут ли эти бактерии оказывать непосредственное влияние на ГАМКергическую систему. Параллельно, поведение, относящееся к ГАМКергической нейротрансмиссии и реакции на стресс, оценивалось после введения L. rhamnosus ( JB-1 ). Наконец, роль блуждающего нерва в опосредовании таких эффектов также была исследована путем изучения этих параметров у мышей с субдиафрагмальной ваготомией.

Результаты

Поведенческие эффекты администрации L. rhamnosus ( JB-1 ).

Был проведен ряд поведенческих тестов, связанных с тревогой и депрессией. Тесты на стресс-индуцированную гипертермию (SIH) и повышенный уровень лабиринта (EPM) широко используются для оценки функциональных последствий изменений в нейротрансмиссии ГАМК ( 22 , 23 ). Хроническое введение L. rhamnosus ( JB-1 ) приводило к незначительному снижению SIH ( t = 1,567, df = 34; P = 0,1263;). На EPM животные, обработанные L. rhamnosus ( JB-1 ), имели большее количество входов в открытые руки, чем животные, вскармливаемые бульоном, что предполагает анксиолитический эффект (вход в открытую руку определяется как все четыре лапы, входящие в руки аппарата EPM). ) ( t = 4,662, df = 34; P <0,001;). Этот эффект также отражается в процентах времени, проведенного в распростертых объятиях, хотя это наблюдение не достигло статистической значимости [бульон против L. rhamnosus ( JB-1 ): 25,28 ± 6,67% против 38,36 ± 7,99%; t = 1,267, df = 34; P = 0,2146].

Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на поведение и стресс-индуцированные уровни кортикостерона. ( A ) Гипертермия, вызванная стрессом (SIH). Не было никаких существенных различий между животными с кормом L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 16) и животными, получавшими бульон ( n = 20). Повышенный плюс лабиринт (EPM). Мышей, которых кормили Lactobacillus ( n = 16), вводили значительно больше раз (*** P <0,001) в открытые плечи аппарата EPM по сравнению с мышами, вскармливаемыми бульоном ( n = 20). ( C ) Тест принудительного плавания (FST). Животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 8), проводили меньше неподвижного времени (** P <0,01) по сравнению с мышами, вскармливаемыми бульоном ( n = 8). ( B ) Влияние L. rhamnosus ( JB-1 ) на поведение, связанное со страхом. В 1-й день анализ не выявил различий в кривых обучения у мышей, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 16) и контрольных животных, которых кормили бульоном ( n = 20). На 2-й день (тестирование памяти) животные, обработанные L. rhamnosus ( JB-1 ), показали улучшенную память по отношению к сигналам (представлены белыми рамками под осью x . ** P <0,01 для сигнала № 5 и * P <0,05). для кия № 6) и контекст (представлен серыми прямоугольниками под осью x . * P <0,05 для контекста 6). На 3-й день (угасание памяти) различий между двумя группами лечения не наблюдалось. ( C ) Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на вызванные стрессом уровни кортикостерона. Стресс-индуцированный кортикостерон измеряли в плазме через 30 минут после FST. Уровни кортикостерона, вызванные стрессом, значительно ниже у мышей, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), по сравнению с контрольными животными, получавшими бульон (### P <0,001).

Обусловление страха также является идеальным методом для оценки когнитивных аспектов тревожного поведения, и считается, что реакция на контекст и конкретные сигналы отражают изменения в гиппокампе и миндалине соответственно ( 24 , 25 Анализ общего трехмерного поведения замораживания (общий процент поведения замораживания в каждый день) показал значительное взаимодействие между днем ​​кондиционирования и обработкой L. rhamnosus ( JB-1 ) [ F (2, 62) = 5,394; Р <0,01]. Кроме того, наблюдался значительный эффект кондиционирования дня [ F (2, 62) = 19,31; P <0,0001], тогда как общий эффект от лечения L. rhamnosus ( JB-1 ) не был значительным [ F (1, 62) = 1,469; P = 0,2346]. Последующий анализ не выявил существенных различий в процентном соотношении поведения замораживания на первой (приобретение) или третьей (вымирание) фазах, но показал значительный эффект на 2-й день (фаза отзыва) теста. После разделения анализа на приступы замораживания компонентов было обнаружено, что эти различия обусловлены значительно более высоким процентом поведения замораживания у мышей, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ) во время сеансов кия 5 ( P <0,01) и 6 ( P <0,05) и контекстный сеанс 6 ( P <0,05) по сравнению с мышами, вскармливаемыми бульоном ().

Что касается поведения, связанного с депрессией, анализ теста принудительного плавания (FST) показал, что животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), проводили значительно меньше времени в неподвижном состоянии по сравнению с мышами, вскармливаемыми бульоном ( t = 3,926, df = 14; P < 0,01;).

Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на уровень кортикостерона, вызванного стрессом.

Имелась значительная взаимосвязь между острым стрессом и лечением L. rhamnosus ( JB-1 ) [ F (1, 28) = 7,425; P = 0,011], значительный эффект острого стресса [ F (1, 28) = 73,90; P <0,0001] и лечение L. rhamnosus ( JB-1 ) [ F (1, 28) = 11,409; P = 0,0022] на уровне кортикостерона. Анализ post hoc показал, что уровни кортикостерона, вызванного стрессом, значительно ниже у мышей, подвергшихся стрессу, которые получали L. rhamnosus ( JB-1 ) ( P <0,001), чем уровни гормона у мышей, которых кормили бульоном ().

Влияние L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию ГАМК-рецепторов.

МРНК GABAB1b.

Было разное выражение этого транскрипта в разных изученных областях. Более высокие уровни мРНК GABAB1b были обнаружены в кортикальных областях поясной извилины 1 (CG1) () и предлимбических (PrL) () мышей, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), по сравнению с мышами, вскармливаемыми бульоном ( t = 3,485, df). = 10, P <0,01 и t = 2,965, df = 10, P <0,05 соответственно), но никаких различий не наблюдалось в инфралимбической (IL) коре ( t = 0,4558, df = 10, P = 0,658;). Напротив, у мышей, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), были более низкие уровни мРНК GABAB1b в базолатеральной миндалине (BLA) ( t = 8,778, df = 10, P <0,001;) и в центральной миндалине (CeA) ( t = 3,3372 , df = 10, P <0,01;), locus coeruleus (LC) ( t = 5,339, df = 10, P <0,001;), гиперпокампальные подзоны зубчатой ​​извилины (DG) ( t = 5,555, df = 10, P <0,001;), область 3 Cornus Ammonis (CA3) ( t = 3,207, df = 10, P <0,01;) и область 1 Cornus Ammonis (CA1) ( t = 3,826, DF = 10, P <0,01;) по сравнению с контрольными мышами, получавшими бульон.

Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на центральную экспрессию мРНК GABAB1b. Мыши, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 6), имели более высокие уровни мРНК GABAB1b в cingulate 1 (CG1) ( A ) и предлимбической (PrL) ( B ) кортиках по сравнению с контрольными мышами, которых кормили бульоном ( n = 6) Тем не менее, никаких различий между двумя группами не наблюдалось в инфралимбической (ИЛ) коре ( С ). С другой стороны, животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), показали пониженные уровни мРНК GABAB1b в базолатеральной миндалине (BLA) ( D ), центральной миндалине (CeA) ( E ), locus coeruleus (LC) ( F ), зубчатая извилина (DG) ( G ), область 3 аммиака в мозоли (CA3) ( H ) и область 1 аммиака в мозоли (CA1) ( I ) по сравнению с мышами, получавшими бульон. Значения представляют плотность пикселей (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001).

МРНК GABAAα2.

Также была обнаружена дифференциальная экспрессия мРНК GABAAα2 в исследуемых областях (). У животных, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), были низкие уровни мРНК GABAAα2 в CG1 ( t = 2,611, df = 10, P <0,05;), PrL ( t = 2,267, df = 10, P <0,05 ;) и IL ( t = 2,803, df = 10, P <0,05;) областей коры, а также в BLA ( t = 7,541, df = 10, P <0,001;) и CeA ( t = 7,150, df = 10, P <0,001;) по сравнению с мышами, вскармливаемыми бульоном. Кроме того, не было обнаружено различий в мРНК GABAAα2 в LC между двумя группами мышей ( t = 1,190, df = 10, P = 0,2616;); однако более высокие уровни мРНК GABAAα2 были обнаружены у DG мышей, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), по сравнению с контрольными животными, получавшими бульон ( t = 5,967, df = 10, P <0,001;). Никаких различий в мРНК GABAAα2 не обнаружено в CA3 ( t = 0,403, df = 10, P = 0,6955;) и CA1 ( t = 2,161, df = 10, P = 0,0560;) в нейронном слое гиппокампа L. rhamnosus ( JB). -1 ) по сравнению с бульонными мышами.

Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на центральную экспрессию мРНК GABAAα2. Мыши, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 6), имели более низкие уровни мРНК GABAAα2 в CG1 ( A ) PrL ( B ) и IL ( C ) кортиках. Кроме того, мРНК GABAAα2 также была снижена у мышей, которых кормили BLA ( D ) и СеА ( E ), у мышей L. rhamnosus ( JB-1 ) по сравнению с животными, получавшими бульон. В LC ( F ) различий в мРНК GABAAα2 между двумя группами не наблюдалось. Напротив, мРНК GABAAα2 увеличивается у DG ( G ) животных, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), по сравнению с контрольными мышами с бульоном, но никаких различий не наблюдалось у CA3 ( H ) и CA1 ( I ). Значения представляют плотность пикселей (* P <0,05; *** P <0,001).

Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на поведение ваготомизированных мышей.

Чтобы лучше понять роль блуждающего нерва в передаче сенсорной информации в мозг, была проведена субдиафрагмальная ваготомия (Vx) и определены поведенческие параметры. Как показано в двухстороннем анализе ANOVA, было выявлено, что общий эффект Vx был общим [ F (1, 36) = 8,91; P <0,01], общий эффект от лечения L. rhamnosus ( JB-1 ) [ F (1, 36) = 5,80; P <0,05] и взаимодействие между Vx и L. rhamnosus ( JB-1 ) [ F (1, 36) = 5,690; Р <0,05]. В отношении времени в центре арены открытого поля Vx предотвращал анксиолитическое действие L. rhamnosus ( JB-1 ) на мышей, что отражается в сокращении времени, проведенного в центре открытого поля, по сравнению с фиктивным хирургические животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ) ( P <0,05). То, что Vx предотвратил анксиолитический эффект L. rhamnosus ( JB-1 ), еще раз подтверждается, потому что анализ количества записей в центральной области открытого поля отражает такой же профиль, как и в процентах времени, проведенного в центральной части арена [рис. 6 А ; эффект Vx: F (1, 36) = 5,56, P <0,05; эффект L. rhamnosus ( JB-1 ): F (1, 36) = 4,64, P <0,05; взаимодействие между Vx и L. rhamnosus ( JB-1 ): F (1, 36) = 7,66, P <0,01]. Это исследовательское поведение, по-видимому, связано с анксиолитическим эффектом, потому что общее расстояние, пройденное мышами в каждом экспериментальном состоянии, не различалось между ними [ F (1, 36) = 0,44, P = 0,51; ].

Влияние ваготомии (Vx) на тревожное и депрессивное поведение и экспрессию субъединиц GABAA у животных, получавших L. rhamnosus ( JB-1 ). ( A ) Мыши, обработанные Sham / L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 10) (белые столбики), проводили больше времени в центральной области арены открытого поля по сравнению с животными с поддельным / бульоном ( n = 10) (черный цвет). бары). Это поведение отражается в количестве входов в центральную область открытого поля у мышей с поддельными / L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 10), которые выполняют значительно больше входов в эту область, чем животные, обработанные имитаторами / бульонами. Это поведение предотвращается Vx. Эти различия не связаны с влиянием на локомоцию, поскольку расстояние, пройденное в открытом поле, не отличается между экспериментальными группами. У шаманов FST / L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 10) мышей проводили меньше времени в неподвижности, чем у животных с поддельными / бульонными ( n = 10) эффектом, предотвращаемым Vx. ( B ) Мыши Sham / L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 6) имеют значительно более высокие уровни экспрессии мРНК GABAAα2 в областях DG и CA3 по сравнению с животными с имитацией / бульоном ( n = 6). Никаких существенных различий в СА1 между теми же экспериментальными группами не наблюдалось. Vx предотвращал любое дальнейшее воздействие L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию мРНК гиппокампа GABAAα2 в DG CA3 и CA1. ( C ) Мыши Sham / L. rhamnosus ( JB-1 ) ( n = 6) имеют значительно более низкие уровни мРНК GABAAα1 у DG, CA3 и CA1 по сравнению с животными с имитацией / бульоном ( n = 6). Vx предотвращал любое влияние L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию мРНК гиппокампа GABAAα1 в областях DG, CA3 и CA1 в двух экспериментальных группах. (* P <0,05; *** P <0,001).

Кроме того, FST показал, что был общий эффект Vx [ F (1, 36) = 5,14, P <0,05], общий эффект лечения L. rhamnosus ( JB-1 ) [ F (1, 36) = 10,47 , P = 0,01], и взаимодействие между Vx и L. rhamnosus ( JB-1 ) [ F (1, 36) = 6,22, P <0,05] с точки зрения времени неподвижности. Последующий анализ показал, что фиктивные животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), имели значительно меньшее время подвижности ( P <0,05) по сравнению с фиктивными животными, которых кормили бульоном (). Этот эффект был предотвращен Vx, потому что время неподвижности животных Vx, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), было похоже на время неподвижности контрольных мышей ( P > 0,05).

Влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию мРНК рецептора ГАМК: роль блуждающего нерва.

В нашей первой серии исследований мы показали, что введение L. rhamnosus ( JB-1 ) в течение 28 дней оказало заметное и отчетливое влияние на экспрессию транскриптов для субъединиц рецепторов GABAB1b и GABAAα2 в префронтальной коре, миндалине, гиппокампе и LC по сравнению с бульонными животными. Эти данные свидетельствуют о том, что наблюдаемые изменения в поведении могут быть вызваны влиянием L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию мРНК мозга. Таким образом, чтобы выяснить механистические способы того, как L. rhamnosus ( JB-1 ) может влиять на экспрессию мРНК рецептора ГАМК, гибридизацию in situ двух основных субъединиц рецептора ГАМК проводили в мозге мышей Vx.

МРНК GABAAα2.

Статистический анализ показал, что существует значительная взаимосвязь между лечением L. rhamnosus ( JB-1 ) и Vx на уровнях мРНК GABAAα2 [ F (1, 20) = 5,674, P = 0,0273] в BLA, а также в CeA [ F ( 1, 20) = 4,756, P = 0,0413]. Также имеется эффект Vx в обеих областях [BLA: F (1, 20) = 8,532, P = 0,0084; CeA: F (1, 20) = 4,84, P = 0,0397] и эффект лечения только в BLA [F (1, 20) = 12,75, P = 0,0019], но не в CeA [ F (1, 20). ) = 3,586, Р = 0,0728; Рис. S1 ]. Анализ post hoc показал, что у поддельных животных L. rhamnosus ( JB-1 ) значительно снижал уровни мРНК GABAAα2 в областях BLA ( P <0,001) и CeA ( P <0,05) по сравнению с фиктивными животными, которых кормили бульон ( Рис. S1 A и B ), что согласуется с нашими первоначальными результатами (). Этот эффект на транскрипт GABAAα2 был полностью предотвращен Vx ( Рис. S1 C и D ).

В гиппокампе ANOVA выявило отсутствие взаимодействия между L. rhamnosus ( JB-1 ) и Vx на уровнях мРНК GABAAα2 в любой из исследованных областей [DG: F (1, 20) = 3,47, P = 0,0772; CA3: F (1, 20) = 1,84, P = 0,1900; CA1: F (1, 20) = 1,51, P = 0,2327]. Тем не менее, он показал эффект L. rhamnosus ( JB-1 ) в DG [ F (1, 20) = 6,36, P = 0,02038], а также в CA3 [ F (1, 20) = 6,66, P = 0,0179 ], но не в CA1 [F (1, 20) = 4,13, P = 0,0557]. Кроме того, эффект Vx наблюдался только в DG [ F (1, 20) = 5,86, P = 0,0248], но не в CA3 [ F (1, 20) = 3,09, P = 0,0941] или CA1 [ F ( 1, 20) = 1,47, P = 0,2393]. Последующий анализ показал, что фиктивные животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), имели значительно более высокие уровни мРНК GABAAα2 в DG ( P <0,05) и CA3 ( P <0,05;) по сравнению с фиктивными животными, которых кормили бульоном. Vx у животных, вскармливаемых бульоном, увеличивал уровни мРНК GABAAα2 в различных областях гиппокампа, в то время как L. rhamnosus ( JB-1 ) не влиял на действие Vx на гиппокамп (репрезентативные изображения в Рис. S2 ).

GABAAα1 мРНК.

Денситометрический анализ мРНК GABAAα1 показал взаимодействие между обработкой Vx и L. rhamnosus ( JB-1 ) в обеих исследованных областях миндалины [BLA: F (1, 20) = 33,43, P <0,0001; CeA: F (1, 20) = 15,19, P = 0,0009; Рис. S3 ]. Этот анализ выявил влияние Vx на мРНК GABAAα1 [BLA: F (1, 20) = 49,80, P <0,0001; CeA: F (1, 20) = 73,91, P <0,0001) и влияние введения L. rhamnosus ( JB-1 ) на этот же транскрипт [BLA: F (1, 20) = 44,53, P <0,0001; CeA: F (1, 20) = 12,77, P = 0,0019). Последующий анализ показал, что у животных, которым была сделана ложная операция Vx и которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), выявлено значительное снижение мРНК GABAAα1 в BLA ( P <0,0001; Рис. S3 A ) и CeA ( P <0,0001; Рис. S3 B ), по сравнению с фиктивными животными, которых кормят бульоном. Кроме того, никаких различий в мРНК GABAAα1 не было обнаружено у L. rhamnosus ( JB-1 ) или животных с VX, получавших бульон, по сравнению с ложными контрольными мышами.

В гиппокампе анализ уровней мРНК GABAAα1 выявил взаимодействие между обработкой Vx и L. rhamnosus ( JB-1 ) во всех исследованных областях [DG: F (1, 20) = 21,80, P = 0,0001; CA3: F (1, 20) = 19,133, P = 0,0003; CA1: F (1, 20) = 22,87, P = 0,0001; ]. Кроме того, эффект L. rhamnosus ( JB-1 ) наблюдался в DG [ F (1, 20) = 12,49, P = 0,0021], CA3 [ F (1, 20) = 13,49, P = 0,0015], и в CA1 [ F (1, 20) = 25,66, P <0,0001]. Однако эффект Vx наблюдался только в DG [ F (1, 20) = 9,751, P = 0,0054], но не в CA3 [ F (1, 20) = 2,335, P = 0,1404] или CA1 [ F (1, 20) = 1,28, P = 0,2713]. После специального анализа было обнаружено значительное снижение мРНК GABAAα1 в DG ( P <0,0001), CA3 ( P <0,0001) и CA1 ( P <0,0001;) по сравнению с ложными контрольными животными, которых кормили только бульоном. Vx не влиял на экспрессию мРНК GABAAα1 у животных, получавших бульон, и предотвращал влияние L. rhamnosus ( JB-1 ) на экспрессию мРНК GABAAα1 в анализируемых областях (репрезентативные изображения в Рис. S4 ).

обсуждение

Эти данные демонстрируют специфические, ранее не описанные нейрохимические изменения, вызванные модуляцией кишечной микробиоты с использованием потенциального пробиотика [ L. rhamnosus ( JB-1 )] у нормальных, здоровых животных ( Таблица S1 ). Кроме того, мы показываем, что L. rhamnosus ( JB-1 ) может оказывать прямое влияние на связанные поведенческие и физиологические реакции способом, который зависит от блуждающего нерва. L. rhamnosus ( JB-1 ) последовательно модулировал экспрессию мРНК рецепторов GABAAα2, GABAAα1 и GABAB1b - рецепторов, участвующих в тревожном поведении - регионально-зависимым образом.

Кроме того, в этом исследовании мы наблюдали, что введение L. rhamnosus ( JB-1 ) уменьшает вызванное стрессом повышение уровня кортикостерона, что позволяет предположить, что воздействие Lactobacillus на ЦНС оказывает существенное влияние на физиологическом уровне. Изменения в оси HPA были связаны с развитием расстройств настроения и, как было показано, влияют на состав микробиоты у грызунов ( 26 ). Наши данные соответствуют предыдущим исследованиям, показывающим, что субхроническое или хроническое лечение антидепрессантами может предотвратить вызванное стрессом принудительное плавание повышение уровня кортикостерона в плазме как у мышей, так и у крыс ( 27 ). Кроме того, было показано, что изменения в модуляции оси HPA могут быть обращены вспять путем обработки Lactobacillus и Bifidobacterium ( 28 , 29 ). Однако следует соблюдать осторожность при экстраполяции нейроэндокринных исследований в один момент времени ( 30 ). Тем не менее, эти данные ясно указывают на то, что в двунаправленном сообщении между мозгом и кишкой ось HPA является ключевым компонентом, на который могут влиять изменения в кишечной микробиоте.

Накопленные данные свидетельствуют о том, что метаботропные ГАМК-рецепторы имеют решающее значение для поддержания нормального поведения. Действительно, генетические и фармакологические исследования показали, что рецепторы ГАМК играют ключевую роль в расстройствах настроения и тревожности ( 13 ). В настоящем исследовании мРНК субъединицы GABAB1b, основной изоформы рецептора GABAB1 в мозге взрослого человека ( 13 ), была увеличена в префронтальной коре животных, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ). Исследования показали, что на животных моделях депрессии снижается экспрессия GABAB-рецепторов во фронтальных корках ( 13 ). Таким образом, заманчиво предположить, что изменения, вызванные Lactobacillus, могут дать преимущество в стрессовых ситуациях по сравнению с контрольными животными, получавшими бульон. Это различие согласуется с наблюдаемыми поведенческими и нейроэндокринными реакциями. В других проанализированных областях (миндалина, гиппокамп и LC) введение L. rhamnosus ( JB-1 ) снижало экспрессию мРНК GABAB1b, что согласуется с антидепрессантным эффектом антагонистов рецепторов GABAB ( 31 ). Животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), продемонстрировали улучшенную память к отвратительному признаку и контексту по сравнению с мышами, получавшими бульон, - наблюдение, которое подразумевает изменения на уровне миндалины и гиппокампа ( 24 ). Эти данные согласуются с данными, полученными от GABAB1b-дефицитных животных, подчеркивая важную роль этой субъединицы в развитии когнитивных процессов, в том числе относящихся к страху ( 32 , 33 ). В соответствии с этими результатами недавно было показано, что лечение определенными бактериями улучшает функцию памяти у инфицированных мышей ( 34 ) а также когнитивные способности у людей ( 35 ). Однако, в отличие от нокаутированных по GABAB1b мышей ( 36 ), Мыши, которых кормят L. rhamnosus ( JB-1 ), способны тушить наученный страх, поведение которого зависит от коры PrL ( 37 ), что может отражать фактическую активацию этой рецепторной субъединицы в этой области мозга.

Миндалина имеет решающее значение для проявления реакции страха и тревоги и для модуляции аффективных компонентов висцерального восприятия. Учитывая повышенные уровни мРНК GABAAα2 в миндалине, обнаружены у стрессированных животных ( 38 ), уменьшение субъединиц ГАМК-рецептора, вызванное Lactobacillus, позволяет предположить, что эти бактерии могли способствовать адаптивному преимуществу по сравнению с животными, получавшими бульон, с точки зрения взаимодействия со стрессовыми ситуациями. Миндалина также необходима для кондиционирования относительно простого стимула или сигнала (условного стимула) и контекста, в котором доставляется безусловный стимул ( 24 , 25 ). Компонентный анализ показал, что животные, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), имели значительно более высокие характеристики замораживания во время последних подсказок и контекста во второй день (фаза отзыва), чем животные, вскармливаемые бульоном, - наблюдение, которое соответствует предыдущему отчеты о мышах BALB / c ( 24 ). Интересно, что было показано, что изменения в экспрессии субъединиц рецептора GABAA влияют на поведение, связанное со страхом, так как генетическая абляция субъединицы GABAAα1 у мышей усиливает поведение замораживания ( 39 ). Стоит отметить, что это усиленное эмоциональное обучение также можно интерпретировать как повышенное тревожное поведение; эта интерпретация предполагает, что L. rhamnosus ( JB-1 ) оказывает различное влияние на обусловленные по сравнению с безусловными аспектами тревоги.

ГАМКергическая нейротрансмиссия в гиппокампе связана с модуляцией процессов поведения и памяти ( 40 ). Кроме того, эта структура требуется для контекстуального кондиционирования, и данные свидетельствуют о том, что инактивация рецепторов ГАБАБ гиппокампа улучшает пространственную рабочую память ( 41 ). В настоящем исследовании мРНК гиппокампа GABAB1b снижена у мышей, которых кормили L. rhamnosus ( JB-1 ), что согласуется с усилением консолидации памяти в тесте формирования страха и далее предполагает, что изменения в экспрессии генов гиппокампа, вызванные Lactobacillus может частично объяснить эти различия в поведении. Введение L. rhamnosus ( JB-1 ) также влияло на транскрипты субъединиц рецептора GABAA в гиппокампе. Хотя различия в экспрессии транскрипта для GABAAα2 и GABAAα1 были обнаружены в гиппокампе крыс, подвергшихся различным задачам обучения, эти изменения не являются последовательными ( 38 , 42 ). Тем не менее, было показано, что рецепторы GABAA, несущие субъединицу GABAAα2, опосредуют анксиолитические эффекты бензодиазепинов, тогда как рецепторы GABAA, которые имеют субъединицу α1, опосредуют седативный и амнезиальный эффекты бензодиазепинов ( 12 ). В настоящем исследовании различия в экспрессии в гиппокампе мРНК GABAAα2 и GABAAα1 подтверждают выводы о поведении, поскольку мыши, питающиеся L. rhamnosus ( JB-1 ), были менее обеспокоены и демонстрировали антидепрессантное поведение по сравнению с контрольными животными, получавшими бульон. Кроме того, можно предположить, что влияние L. rhamnosus ( JB-1 ) на поведение, связанное со страхом, может быть связано с его влиянием на уровень кортикостерона, вызванный стрессом. Введение кортикостерона мышам BALB / c после фазы приобретения (день 1) дестабилизирует консолидацию памяти страха и позволяет быстрее угасать ( 24 ), предлагая механизм, с помощью которого сам кортикостерон мог напрямую влиять на поведение, связанное со страхом. В настоящей работе L. rhamnosus ( JB-1 ) снижал вызванные стрессом уровни кортикостерона, что позволяет предположить, что эти «более низкие» уровни могут лежать в основе наблюдаемых поведенческих изменений.

Блуждающий нерв играет главную роль в передаче изменений в желудочно-кишечном тракте в ЦНС ( 3 ). В настоящем исследовании Vx предотвращал анксиолитическое и антидепрессивное действие L. rhamnosus ( JB-1 ), а также изменения мРНК GABAAα2 и GABAAα1 в миндалине ( СИ Материалы и методы ), а также мРНК GABAAα1 в гиппокампе. Тем не менее, сам по себе Vx был способен повышать уровни мРНК GABAAα2 в гиппокампе, хотя он предотвращал любой дальнейший эффект, вызываемый L. rhamnosus ( JB-1 ), подтверждая наблюдение, что изменения в гиппокампе могут отражать косвенные последствия вызванные Lactobacillus изменения в структурах, получающих прямые висцеральные сенсорные сигналы, которые могут проецировать афференты в гиппокамп. Действительно, было показано, что стимуляция блуждающего нерва у крыс может влиять на функции гиппокампа ( 43 ), и, следовательно, изменения в экспрессии мРНК GABAAα2 в гиппокампе могут происходить в результате Vx. Кроме того, стимуляция блуждающего нерва была описана как успешный подход для лечения некоторых ( 44 ), но не все ( 45 ), пациенты с резистентной к лечению депрессией, что дополнительно указывает на важность блуждающего нерва в модуляции поведения. Мы не можем исключить возможность того, что в кишечнике происходят физиологические изменения, связанные с Vx, которые могут косвенно изменять функциональные аспекты Lactobacillus. Тем не менее, кормление и прибавка в весе были схожими у ваготомизированных и имитированных животных, и мы ранее продемонстрировали, что способность этого организма защищать от колита на мышиной модели не зависит от субдиафрагмального Vx ( 46 ) - убедительный признак того, что местное кишечное противовоспалительное действие не изменено. Молекулярные механизмы, лежащие в основе того, как бактерии влияют на вагинальные афференты, должны быть выяснены в будущих исследованиях.

Одной из важных сторон этих исследований является то, что предполагаемые проблемы в репликации поведенческих данных между лабораториями ( 47 ). Важно отметить, что настоящие нейрохимические наблюдения имеют только изменения на уровне РНК, а не белка, и они могут иметь только более сложную ситуацию с участием других нейротрансмиттерных систем ( 48 ) и различные внутриклеточные каскады, которые могут влиять на экспрессию этих транскриптов в различных изученных областях. Кроме того, пробиотические эффекты зависят от штамма; например, в отличие от L. rhamnosus ( JB-1 ), Lactobacillus salivarius не оказывал нейронно-зависимого воздействия на сокращения гладких мышц кишки мыши, что указывает на маловероятную возможность воздействия L. salivarius на кишечную нервную систему, которая должна возникать до появления сигналов передаются через блуждающий нерв в мозг ( 21 ). Необходимо провести дальнейшее значительное исследование молекулярных механизмов на уровне микробиома, лежащего в основе наблюдаемых эффектов. Более того, будущие исследования с использованием мертвых бактерий, убитых таким образом, чтобы исключить структурные изменения, необходимы для дальнейшего понимания механизма действия этих бактерий ( 19 , 21 ). Тем не менее, наши данные убедительно демонстрируют, что потенциальный пробиотик может надежно изменять нейрохимию и поведение мозга, относящиеся к поведению, связанному с тревожностью и депрессией у мышей.

Таким образом, наши данные с L. rhamnosus ( JB-1 ) позволяют предположить, что непатогенные бактерии могут модулировать ГАМКергическую систему у мышей и, следовательно, могут оказывать благоприятное воздействие при лечении депрессии и тревоги. Кроме того, стоит отметить, что в настоящем исследовании эффекты наблюдались у здоровых животных, в то время как в большинстве исследований, посвященных изучению влияния потенциальных пробиотиков на функцию оси микробиом-кишка-мозг, используются инфицированные, не содержащие микробов или антибиотики. обработанные животные ( 2 , 14 ); Таким образом, последствия этих результатов многообразны для терапевтического потенциала бактерий в модулировании мозга и поведения. Изменения в транскриптах для субъединиц ГАМК-рецептора подчеркивают возможное механистическое понимание потенциального влияния L. rhamnosus ( JB-1 ) на поведение, подобное тревоге ( 12 , 13 ). Однако нельзя исключать участие других нейротрансмиттерных и нейропептидных систем, имеющих отношение к психическим расстройствам, связанным со стрессом, таких как 5-гидрокситриптамин, норэпинефрин, глутамат и кортикотрофин-рилизинг-фактор. Таким образом, в будущих исследованиях следует выяснить, может ли хроническое лечение L. rhamnosus ( JB-1 ) модулировать такие системы и, если да, то как долго могут длиться такие изменения. Кроме того, эффекты L. rhamnosus ( JB-1 ) на уровни нейротрансмиттеров, вероятно, ниже эффектов на оси HPA. Кроме того, блуждающий нерв отвечает за некоторые поведенческие и молекулярные изменения, вызванные L. rhamnosus ( JB-1 ), демонстрируя четкий путь для функциональной связи между бактериями, кишечником и мозгом, который модулирует поведенческие реакции на разные стрессовые ситуации. Стоит отметить, что большинство исследований по оси микробиом-кишка-мозг основаны на грызунах, и в будущем обоснование роли этой оси в модуляции поведения теперь оправдано. Тем не менее, наши текущие исследования предлагают интригующую возможность разработки уникальных микробных стратегий для дополнительного лечения психических расстройств, связанных со стрессом.